Vous avez peut-être entendu parlé de la récente attribution du Prix Nobel de Chimie à la Française Emmanuelle Charpentier et l’Américaine Jennifer Doudna “pour le développement d’une méthode d’édition génomique” [1]. Cette méthode repose sur la machine moléculaire nommée “CRISPR-Cas9” et a joué un rôle important dans le développement de la biologie depuis 2012. Ici, nous présentons les principes de fonctionnement de CRISPR-Cas9 et son utilisation dans les cellules humaines.

L’étude des systèmes CRISPR-Cas remonte aux années 80 où le chercheur Japonais Yoshizumi Ishino les a détectés pour la première fois chez la bactérie Escherichia coli [2]. Notre article n’a pas pour vocation de se concentrer sur les origines et fonctions natives des systèmes CRISPR-Cas. Ces systèmes sont des défenses immunitaires utilisées par la plupart des bactéries pour contrer les bactériophages, des virus qui leurs sont spécifiques [3]. C’est l’un de ces systèmes, nommé “CRISPR-Cas9”, qui a été le plus étudié et le mieux caractérisé [4].

Alors comment fonctionne la machine moléculaire utilisée par Emmanuelle Charpentier et Jennifer Doudna? Rappelons tout d’abord quelques éléments essentiels: un génome est l’ensemble du matériel génétique d’un organisme. Le matériel génétique est composé d’ADN qui est présent dans chacune des cellules de l’organisme. C’est sur le génome que l’on trouve des gènes, qui permettent aux cellules d’exprimer des protéines. Les protéines gouvernent la fonction des cellules et donc de l’organisme, lui permettant de survivre et d’interagir avec son entourage. Nous avions précédemment évoqué ces sujets avec plus de détails sur notre site. Retenons qu’en modifiant un gène, on peut modifier la fonction de la protéine associée à ce gène, et donc le comportement de l’organisme tout entier. Il est également crucial de mentionner que chaque gène est unique et est composé d’une séquence de nucléotides (de symbole A, T, C ou G).

CRISPR-Cas9 est constitué de deux éléments indispensables. Le premier est la protéine Cas9. Cette protéine est une nucléase (glossaire). Elle a la capacité de couper une molécule d’ADN. Néanmoins, Cas9 ne peut pas entrer en action seule. Comme un bateau égaré dans une mer agitée, Cas9 a besoin d’une boussole pour arriver à destination et couper l’ADN. Cette boussole c’est “l’ARN guide”. Comme l’ADN, une molécule d’ARN est également composée d’une séquence de nucléotides unique. La séquence de l’ARN guide est en partie “complémentaire” au gène vers lequel il doit guider Cas9. L’ARN guide se lie à Cas9 tel une clé dans une serrure et la mène à la séquence d’ADN ciblée. Tout ce mécanisme est décrit en première partie de la Figure 1 .

Figure 1: La protéine Cas9 a besoin d’un ARN guide pour cibler un gène précis. L’ARN guide est complémentaire à une partie de la séquence de nucléotides du gène ciblé, ce qui permet à Cas9 de s’y fixer et de le couper. En changeant l’ARN guide, les chercheurs peuvent ainsi cibler, en théorie, l’intégralité des gènes sur un génome. Figure réalisée par Victor Plet.

L’astuce derrière CRISPR-Cas9, c’est que l’ARN guide est modifiable pour que sa séquence de nucléotide soit similaire à la séquence de nucléotide du gène où l’on souhaite amener Cas9 ! En effet, comme chaque gène est unique et possède sa propre séquence de nucléotides, il suffit de lier à Cas9 un ARN guide qui correspond au gène ciblé de par sa séquence de nucléotides. Comme les ARN guide sont de petites molécules, il est très facile de les modifier. Cas9 va ensuite voyager sur le génome, et une fois que l’ARN guide “détecte” le gène ciblé, couper la molécule d’ADN à l’emplacement où le guide s’est arrêté.

Mais quel bénéfice y a-t-il à couper un génome à l’emplacement d’un gène précis? Dans une cellule humaine, l’ADN est un bien précieux qui doit être protégé contre tout dommage venant de l’environnement (comme les rayons UV par exemple). Pour cela, les cellules utilisent divers mécanismes de réparation d’ADN. Les mécanismes de réparation d’ADN les plus utilisés sont le “Non-Homologous End-Joining” (NHEJ) ou le “Homology Directed Repair” (HDR). Ces deux voies sont très différentes. La “NHEJ” emploie des enzymes qui, une fois une cassure dans l’ADN repérée, vont réparer rapidement l’ADN “en catastrophe” comme l’on boucherait une fuite d’eau avec du papier adhésif. Ces réparations entraînent l’apparition de mutations dans la séquence d’ADN, où un nucléotide peut être soit être supprimé, soit remplacé par un autre. D’un autre côté, la réparation “experte” est assurée par la HDR. Celle-ci va utiliser un ADN “patron” pour réparer la cassure. C’est un peu comme réparer un tuyau brisé avec une pièce toute neuve, ce qui est bien sûr plus fiable ! Néanmoins la HDR peut être trompée par les chercheurs qui peuvent lui donner un mauvais patron, que celle-ci fixera en réparation [5] . Cela peut modifier la séquence du gène en profondeur ! Les simples mutations occasionnées par la NHEJ et les tromperies de la HDR entraînent donc une modification de la séquence originelle du gène brisé par Cas9. Comme nous l’avons vu plus haut, cela peut avoir un effet direct sur la protéine codée par ce gène et sa fonction. Il arrive également que les mutations désactivent le gène, supprimant la possibilité pour la cellule de le décoder. NHEJ et HDR sont représentés en Figure 2.

Figure 2: Les cellules humaines disposent de mécanismes de réparation de l’ADN en cas de dommages. Les dommages sur l’ADN peuvent survenir de nombreuses molécules toxiques ou des UV par exemple. Pour se protéger, les cellules humaines utilisent deux mécanismes de réparations, la NHEJ et la HDR. NHEJ commet de nombreuses erreurs qui peuvent changer la séquence du gène réparé. HDR est plus fiable mais peut être manipulé en lui fournissant un « ADN donneur » choisi au préalable. AInsi, Cas9, en coupant son gène cible, occasionne des également une coupure de l’ADN, ce qui va permettre, via à HDR ou NHEJ, de modifier le gène ciblé.

Imaginons maintenant qu’une personne malade possède dans un son génome une version d’un gène dysfonctionnelle. Par exemple, dans la moitié des cancers chez l’Homme, le gène codant pour la protéine p53 est muté et la protéine est modifiée et dysfonctionnelle [6]. Cette protéine est très importante pour empêcher une cellule de se diviser follement. Généralement il suffit d’une variation de quelque nucléotides pour passer d’un gène viable à un gène dysfonctionnel. CRISPR-Cas9 peut couper précisément un gène dysfonctionnel sur la région précise où se trouve la variation clé dans la séquence de nucléotide de ce gène (grâce à l’ARN guide). La coupure peut entraîner mécaniquement la réparation de l’ADN par NHEJ, ou HDR avec une séquence “trompeuse” fournie par les chercheurs, générant une nouvelle version, cette fois-ci viable, du gène !

La NHEJ comme la HDR sont utilisées par les chercheurs pour l’édition génétique, ayant chacune leurs points forts et faibles. Bien sûr, des erreurs peuvent survenir. La HDR et NHEJ sont en compétition pour la réparation de l’ADN et cela empêche de prédire avec certitude les conséquences d’une coupure de l’ADN par Cas9, entraînant dans certains cas des mutations imprévisibles et potentiellement dangereuses [7]. Le guide ARN peut également se tromper de cible, menant Cas9 à une autre séquence d’ADN proche de celle souhaitée [8]. Enfin, la coupure du brin d’ADN cible peut également ne pas être réparée, entraînant la mort de la cellule [9]. Toutes ces failles, résumées en Figure 3, ont limité grandement l’utilisation de Cas9 pour la thérapie génique jusque-là, et font l’objet de nombreuses recherches.

Figure 3: CRISPR-Cas9, malgré ses nombreuses qualités, est loin d’être une machine moléculaire infaillible. C’est avec les nombreuses failles ici présentées que les chercheurs doivent composer pour permettre une utilisation de la technologie en toute sécurité pour l’Homme.

Le principe unissant gènes et protéines est partagé par tous les organismes vivants. Ainsi, CRISPR-Cas9 peut être utilisé théoriquement pour éditer le génome d’une cellule bactérienne comme d’une cellule humaine. Néanmoins, selon l’organisme cible, la méthode pour administrer et utiliser Cas9 et son ARN guide peut grandement varier. Pour les cellules humaines, il existe tout un ensemble de méthode dont l’efficacité est variable est perfectible, raison supplémentaire expliquant la difficulté d’utiliser la technologie chez l’Homme.[10] Néanmoins, CRISPR-Cas9 a contribué grandement à de nombreux domaines de recherche, comme la microbiologie, où son impact a été essentiel durant la dernière décennie.

Un article ne suffit pas à décrire le potentiel de CRISPR-Cas9. CRISPR-Cas9 présente un intérêt gigantesque pour la biologie de synthèse, de par son potentiel à modifier un génome, par exemple celui d’Escherichia coli, et de créer de nouveaux circuits génétiques ou d’en modifier des existants. Nous reviendrons sur CRISPR-Cas9 et la biologie de synthèse dans un autre article. Nous explorerons également dans le futur les problèmes éthiques liés à CRISPR-Cas9 . Nous espérons, cependant, que vous avez une vision plus claire de ce que cette technologie représente et de son fonctionnement.

Paul Lubrano & Victor Plet.

Références:

[1] La vidéo de remise des prix est disponible ici (https://www.nobelprize.org/prizes/chemistry/2020/prize-announcement/)

[2] Ishino Y, Krupovic M, Forterre P. 2018.History of CRISPR-Cas from encounter with a mysterious repeated sequence to genome editing technology. J Bacteriol 200:e00580-17.https://doi.org/10.1128/JB.00580-17.

[3] S. Chen, Y. Yao, Y. Zhang, G. Fan, CRISPR system: discovery, development and off- target detection, Cell. Signal. (2020) 109577.

[4] Doudna JA, Charpentier E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 2014 Nov 28;346(6213):1258096. doi: 10.1126/science.1258096. PMID: 25430774.

[5] Komor AC, Badran AH, Liu DR. CRISPR-Based Technologies for the Manipulation of Eukaryotic Genomes. Cell. 2017 Jan 12;168(1-2):20-36. doi: 10.1016/j.cell.2016.10.044. Epub 2016 Nov 17. Erratum in: Cell. 2017 Apr 20;169(3):559. PMID: 27866654; PMCID: PMC5235943.

[6] Yue X, Zhao Y, Xu Y, Zheng M, Feng Z, Hu W. Mutant p53 in Cancer: Accumulation, Gain-of-Function, and Therapy. J Mol Biol. 2017 Jun 2;429(11):1595-1606. doi: 10.1016/j.jmb.2017.03.030. Epub 2017 Apr 6. PMID: 28390900; PMCID: PMC5663274.

[7] Lieber MR. The mechanism of human nonhomologous DNA end joining. J. Biol. Chem. 2008;283:1–5.

[8] Zhang XH, Tee LY, Wang XG, Huang QS, Yang SH. Off-target Effects in CRISPR/Cas9-mediated Genome Engineering. Mol Ther Nucleic Acids. 2015 Nov 17;4(11):e264. doi: 10.1038/mtna.2015.37. PMID: 26575098; PMCID: PMC4877446.

[9] Uddin F, Rudin CM, Sen T. CRISPR Gene Therapy: Applications, Limitations, and Implications for the Future. Front Oncol. 2020 Aug 7;10:1387. doi: 10.3389/fonc.2020.01387. PMID: 32850447; PMCID: PMC7427626.

[10] Lino CA, Harper JC, Carney JP, Timlin JA. Delivering CRISPR: a review of the challenges and approaches. Drug Deliv. 2018 Nov;25(1):1234-1257. doi: 10.1080/10717544.2018.1474964. PMID: 29801422; PMCID: PMC6058482.